第六章 色谱法

　　色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法。先将混合物中各组分分离而后逐个分析，是分析化合物有力手段。具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快、应用范围广等优点。

　　第一节 概论

　　一、基本原理
　　色谱过程是物质分子在相对运动的两相(固定相和流动相)间分配平衡的过程，可用分配系数k和容量因子k描述。
　　1.分配系数k=cs/cm，与组分、固定相和流动相性质和温度有关。
　　2.容量因子k＝ws/wm，不仅与组分、固定相和流动相性质和温度有关，还与两相体积有关。容量因子不等是色谱分离的先决条件。
　　3.色谱过程方程：保留时间与分配系数关系tr=t0(1 k)

　　二、分类
　　1．按分离原理
　　(1) 吸附色谱法：固定相为固体
　　(2) 分配色谱法：固定相为液体
　　(3) 离子交换色谱法：固定相为离子交换树脂
　　(4) 分子排阻色谱法：固定相为多孔填料
　　2．按操作形式：平面色谱、柱色谱、电泳法
　　3．按两相物态：气相色谱、液相色谱

　　第二节 薄层色谱法
　　一、基本原理
　　吸附剂对不同组分a和b具有不同吸附能力，展开剂也对a和b有不同溶解、解吸能力，当展开剂不断展开，a、b在吸附剂和展开剂之间连续不断吸附解吸，产生差速迁移得到分离。

　　二、固定相
　　1．硅胶：含水量越高，活性越低，吸附力越弱。在105～110℃加热30min，使其活化。硅胶g、硅胶h、硅胶gf254、硅胶hf254的含义
　　2．氧化铝：碱性、中性和酸性三种。活性与含水量有关
　　3．聚酰胺：可与酚羟基、羧基、氨基酸形成氢键，选择性高

　　三、操作方法
　　1．制备：1份固定相与3份水混合涂布，110℃烘30分钟
　　2．点样与展开：点样一般为直径2～4mm圆点，距底2.0cm；展开距离一般为10～15cm。
　　3．检视：荧光板在紫外光下检视；普通薄层板用物理方法或显色剂显色。
　　4．系统适用性试验
　　比移值：rf＝l/l0，为组分迁移距离与展开剂迁移距离之比
　　比移值的最佳范围是0.3～0.5，可用范围是0.2～0.8。
　　影响比移值因素：①被分离物质的结构和性质。极性较强的组分rf较小。②薄层板性质。吸附剂活性越强，rf较小。③展开剂性质。极性越强展开剂rf值增大④展开剂蒸气饱和程度。
　　3.分离度：r=2d/(w1 w2)，两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度的比值

　　四、应用
　　1.鉴别：比较供试品与对照品溶液的比移值
　　2.杂质检查：杂质对照品比较法；自身稀释对照法

　　第三节 高效液相色谱法
　　一、基本原理
　　1．基本概念
　　色谱峰参数：峰高或峰面积(用于定量)，峰位(保留值表示，用于定性)，峰宽(用于衡量柱效)
　　保留值：保留时间、死时间、调整保留时间
　　峰宽：标准差、半峰宽、峰宽
　　2.塔板理论：把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇的在单个塔板中的分配平衡过程
　　理论塔板数 n=5.54(tr/wh/2)2
　　色谱柱的理论塔板数越多，柱效越高；同样长度中塔板高度越小，柱效越高。
　　3.速率理论：主要说明使色谱峰扩张而降低柱效的因素
　　范氏方程 h=a b/μ cμ
　　a为涡流扩散项。采用适当粒度、均匀的填料并填充均匀可减小涡流扩散
　　b为纵向扩散系数。流动相为液体，柱温为室温，b/μ可忽略不计
　　c为传质阻抗系数。在能完全覆盖载体表面的前提下，应适当减少固定液用量。

　　二、高效液相色谱仪
　　1.高压输液泵
　　2.色谱柱：分析型和制备型
　　3.进样阀
　　4.检测器
　　（1）选择性检测器：与待测物浓度、结构有关
　　①紫外检测器：灵敏度、重复性及线性范围较好，适用于具有共轭结构的化合物的检测
　　②光二极管阵列检测器：检测原理相同，可同时记录待测物吸收光谱，用于光谱鉴定和纯度检查
　　③荧光检测器：灵敏，用于在流动相条件下具有荧光或经衍生转化为具有荧光的化合物的检测
　　④电化学检测器：灵敏度高，仅用于在流动相条件下发生氧化－还原反应的化合物
　　⑤质谱检测器：高灵敏度、高选择性、分析范围广；不适用于小分子化合物，主要用于大分子物质如蛋白质、多肽的检测
　　（2）通用性检测器：质量型检测器
　　①示差折光检测器：仅对少数物质如糖类灵敏度较高，受环境温度影响大，实际应用少
　　②蒸发光散射检测器：适用于uv检测困难的物质的分析，响应值与浓度通常不呈线性关系。

　　三、吸附色谱法
　　1．原理：被分离组分与流动相对吸附剂吸附能力的差异
　　2．常用固定相和流动相
　　固定相：硅胶、氧化铝、高分子多孔微
　　流动相：烷烃加极性调节剂；极性越强，洗脱能力越强

　　四、分配色谱法
　　1．原理：被分离组分溶入互不相溶的固定相与流动相，达到平衡后浓度之比（分配系数）的差异
　　正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性。极性小的组分先流出，极性大的组分后流出。用于分离极性及中等极性物质
　　反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性。极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。应用广泛，用于分离非极性至中等极性物质
　　离子对反相色谱：在流动相中加入有机离子对试剂，用于有机酸、碱、盐的分离
　　离子抑制色谱：调整流动相ph，抑制组分的解离
　　2．常用固定相和流动相
　　（1）固定相：化学键合相
　　非极性：十八烷基硅烷键合硅胶
　　极性：氨基和氰基硅烷键合相
　　（2）流动相
　　正相色谱：烷烃加极性调节剂
　　反相色谱：甲醇－水、乙腈－水

　　五、色谱系统适用性试验
　　固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变，其余可适当改变以达到色谱系统适用性试验要求
　　1.理论塔板数：不得低于各品种项下规定的最小理论塔板数
　　2.分离度：除另有规定外，分离度应大于1.5
　　3.重复性：取各品种项下对照品2连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差不大于2.0％
　　4.拖尾因子：除另有规定外，拖尾因子应在0.95～1.05之间